Quando a atividade de VWF é desproporcionalmente reduzida em comparação com VWF:Ag (razão < 0,7), é necessária uma subtipagem adicional para discriminar entre os tipos 2A, 2B e 2M.
Agregação plaquetária induzida por ristocetina
O método, realizado em agregômetro baseia-se na captação da luz transmitida através da suspensão de plasma rico em plaquetas do paciente. A transmissão da luz aumenta com a formação de aglutinados plaquetários, após a adição de ristocetina em concentrações diferentes (baixa e alta concentrações).
Na DVW tipo 3, não se observa aglutinação plaquetária nas duas concentrações, o que também pode ocorrer em DvW tipo 2A e 2M, uma vez que os multímeros de alto peso molecular têm um papel importante nesse processo. Uma aglutinação com baixa concentração de ristocetina é característica da DVW tipo 2B, devido ao aumento da afinidade entre o VWF e a GPIb. Nos outros tipos de DVW, o teste apresenta resultados variáveis.
Embora um RIPA aumentado seja geralmente devido a uma variante com ganho de função na VWF (DVW tipo 2B), também pode ser devido a uma variante com ganho de função da GPIb (DVW do tipo plaquetário), que leva à ligação espontânea do VWF normal circulante à GPIb mutante e resulta em um fenótipo semelhante a DVW tipo 2B, embora seja intrinsecamente um defeito plaquetário. Essa distinção pode ter implicações para o tratamento.
Análise multimérica do VWF
O padrão multimérico do VWF pode ser avaliado por meio de eletroforese em gel de SDS-agarose, na concentração de 1,0 a 1,5% de agarose com polimerização em elevada temperatura. Na DVW tipo 3, nota-se ausência de bandas, ao passo que na DVW tipo 2A os multímeros de alto e intermediário peso molecular não estão presentes e no tipo 2B apenas os multímeros de alto peso molecular não são visualizados. A DVW tipo 1 apresenta uma diminuição global e homogênea, envolvendo multímeros de todos os pesos moleculares, mas a composição multimérica e intensidade das bandas podem também mostrar-se normais.
Ensaio de ligação entre VWF e FVIII (VWF:FVIIIB)
Os métodos utilizados para detecção da afinidade entre VWF e FVIII podem ser cromogênico ou imunológico (ELISA). São utilizadas placas com FVIII fixado. Trata-se de um método importante para discriminar entre a DVW tipo 2N e a hemofilia A. Uma ligação reduzida entre FVIII:C com VWF:Ag é indicativa de VWD tipo 2N.
Ensaio de ligação entre VWF e colágeno
Este método avalia a capacidade do VWF de se ligar ao colágeno (VWF:CB - Collagen Binding Assay). A presença de multímeros de alto peso molecular e a quantidade total normal do VWF:Ag são condições fundamentais para um teste normal. Portanto, espera-se uma diminuição do VWF:CB na DVW por déficit quantitativo (tipos 1 e 3) e nas variantes do tipo 2 em que há uma diminuição dos multímeros de alto peso molecular ou alteração no sítio de ligação do VWF com o colágeno.